The N Terminus of Myxococcus xanthus CarA Repressor Is an Autonomously Folding Domain That Mediates Physical and Functional Interactions with Both Operator DNA and Antirepressor Protein
The N Terminus of Myxococcus xanthus CarA Repressor Is an Autonomously Folding Domain That Mediates Physical and Functional Interactions with Both Operator DNA and Antirepressor Protein
Pérez-Marín MC, López-Rubio JJ, Murillo FJ, Elías-Arnanz M, Padmanabhan S.
JBC, 279, 33093-33103, 2004
タンパク質-タンパク質やタンパク質-DNA相互作用を調べる実験はいろいろある。免沈-WB、pull-down assay、転写因子ならルシフェラーゼアッセイやEMSA。
ちょうどゲル濾過が毎日のように走っているので、これで証明できないかと思って調べていて見つけたのがこの論文。これでOKなら、キットを買うよりも簡単そうだ。
・カロテノイド生合成に関わる carB オペロンは、暗黒条件下では CarA によって抑制される。
・光が当たると、CarS が CarA と直接相互作用することによって、この抑制を外す。
・この論文では、CarA の N 末端ドメインがタンパク質同士および DNA との相互作用に重要なことを示している。
ゲル濾過の Fig. 5 を中心に解説。
A と B は基本的に同じ手法なので、A のみ。横軸が時間ではなく volume なので、左側が高分子量になる。下のパネルは CarA の N 末端部分および CarS をそれぞれ単独で流し、elution pattern をマージしたもの。上のパネルは mix。大きい分子量のピークが現れている。それぞれの分子量も正確に計算している。
FIG. 5. Analysis of CarA(Nter)-CarS interactions by analytical gel filtration. Shown are elution profiles off Superdex-200 in 150 mM NaCl, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), 1.4 mM -mercaptoethanol, at room temperature. A, mixtures of CarA(Nter) and CarS. The corresponding His6-tagged proteins were cleaved with thrombin; CarA(Nter) was purified by reverse-phase HPLC, and CarS was purified by dialysis. B, mixtures of CarA(Nter) (as in A) and His6-CarS1. The bottom panels show the elution profiles for the pure proteins; the top panels show mixtures of the two proteins in equimolar amounts (a), or with a 2-fold (b) or 3-fold (c) molar excess of CarS or CarS1 over CarA(Nter). Note that the extinction coefficient at 280 nm is considerably lower for CarS1 (1 Tyr) than for CarS (1 Tyr and 1 Trp) as listed under “Experimental Procedures.” The apparent molecular weights calculated from the elution volumes are described in the text.
他の方法ではタンパク質相互作用を調べておらず、これが唯一のデータ。信頼性が高い手法と言えるだろう。この論文では DNA との結合も見ているが、これは放射性ラベルを使った普通のゲルシフトアッセイ。
Pérez-Marín MC, López-Rubio JJ, Murillo FJ, Elías-Arnanz M, Padmanabhan S.
JBC, 279, 33093-33103, 2004
タンパク質-タンパク質やタンパク質-DNA相互作用を調べる実験はいろいろある。免沈-WB、pull-down assay、転写因子ならルシフェラーゼアッセイやEMSA。
ちょうどゲル濾過が毎日のように走っているので、これで証明できないかと思って調べていて見つけたのがこの論文。これでOKなら、キットを買うよりも簡単そうだ。
・カロテノイド生合成に関わる carB オペロンは、暗黒条件下では CarA によって抑制される。
・光が当たると、CarS が CarA と直接相互作用することによって、この抑制を外す。
・この論文では、CarA の N 末端ドメインがタンパク質同士および DNA との相互作用に重要なことを示している。
ゲル濾過の Fig. 5 を中心に解説。
A と B は基本的に同じ手法なので、A のみ。横軸が時間ではなく volume なので、左側が高分子量になる。下のパネルは CarA の N 末端部分および CarS をそれぞれ単独で流し、elution pattern をマージしたもの。上のパネルは mix。大きい分子量のピークが現れている。それぞれの分子量も正確に計算している。
FIG. 5. Analysis of CarA(Nter)-CarS interactions by analytical gel filtration. Shown are elution profiles off Superdex-200 in 150 mM NaCl, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), 1.4 mM -mercaptoethanol, at room temperature. A, mixtures of CarA(Nter) and CarS. The corresponding His6-tagged proteins were cleaved with thrombin; CarA(Nter) was purified by reverse-phase HPLC, and CarS was purified by dialysis. B, mixtures of CarA(Nter) (as in A) and His6-CarS1. The bottom panels show the elution profiles for the pure proteins; the top panels show mixtures of the two proteins in equimolar amounts (a), or with a 2-fold (b) or 3-fold (c) molar excess of CarS or CarS1 over CarA(Nter). Note that the extinction coefficient at 280 nm is considerably lower for CarS1 (1 Tyr) than for CarS (1 Tyr and 1 Trp) as listed under “Experimental Procedures.” The apparent molecular weights calculated from the elution volumes are described in the text.
他の方法ではタンパク質相互作用を調べておらず、これが唯一のデータ。信頼性が高い手法と言えるだろう。この論文では DNA との結合も見ているが、これは放射性ラベルを使った普通のゲルシフトアッセイ。
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